基因组|CRISPR/Cas9克隆_pre-CRISPR|sgRNA|蛋白质

【基因组|CRISPR/Cas9克隆】

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CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫防御系统，用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒等。 CRISPR/Cas作为一种新型的基因组编辑技术，具有构建简单、成本低且效率高等特点，被研究人员认定为哺乳动物细胞中精确而高效的基因组编辑的突破性方法，被得到越来越广泛的应用，成为实验室中的常用工具。维真生物提供CRISPR/Cas9克隆(服务内容见下面) ，以及AAV、慢病毒和腺病毒的病毒制备服务。您只需向我们提供您的项目详细信息，我们即可生产出即用型质粒或病毒产品，从而节省您的时间和精力。

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*如您对上述服务感兴趣，请您点击“欢迎垂询”留下您的信息，我们将为您提供具体实验方案和项目价格。
相关服务：腺病毒包装慢病毒包装腺相关病毒 sgRNA干扰效果验证 KO细胞系建立

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CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)系统是细菌在噬菌体长期选择压力下，进化出的一种有效的获得性免疫机制。
CRISPR簇广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是一个特殊的DNA重复序列家族。其由一个前导区（leader）、多个重复序列区（repeat）和多个间隔区（spacer）构成。前导区被认为可能是CRISPR簇的启动子，重复序列区可形成发卡结构，间隔区由俘获的外源DNA组成。
CRISPR簇附近存在一个多态性家族基因，编码的蛋白质均具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性，并能与CRISPR区域发生相互作用，被命名为Cas（CRISPR associated）基因。
当外源DNA入侵时，在前导区的调控下， CRISPR被转录为长的RNA前体（pre-CRISPR RNA ，pre-crRNA），并通过加工成为一系列含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA ，然后识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。
CRISPR/Cas9作用原理
根据Cas蛋白质和参与序列的不同，将目前发现的CRISPR/Cas系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中， Ⅰ型和Ⅲ型需要多种Cas蛋白共同发挥作用，而Ⅱ型由Cas9单独参与，是研究较为深入的一种类型。
在pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA（trans-activating crRNA ， tracrRNA）也转录出来。 Cas9首先与crRNA和tracrRNA结合形成复合物，此复合物通过与PAM序列结合并侵入DNA ，形成RNA-蛋白-DNA复合结构，进而在与crRNA配对的序列靶点剪切双链DNA 。
通过人工设计这两种RNA ，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（single guide RNA），通过将表达sgRNA的元件与表达Cas9的元件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，便能够对目的基因进行操作，以引导Cas9对DNA的定点切割。
CRISPR/Cas9系统的作用原理（Zhang Feng ， 2013）
CRISPR/Cas9系统元件
CRISPR/Cas9系统需要两个关键基因序列：gRNA和Cas9 ， gRNA的功能是识别目的DNA序列，并引导Cas9蛋白到目的基因序列处进行切割。 gRNA序列由两部分组成：能够与目的基因匹配的序列和能够与Cas9蛋白结合的序列。 Cas9是一种能切割DNA双链的核酸内切酶，在匹配的基因的PAM序列的下游3-4碱基处进行DNA双链的切割。
spCas9 & saCas9
根据PAM序列的不同， Cas9分为spCas9和saCas9两种。
saCas9基因序列长约3.3kb ， spCas9基因序列长约4.1kb ，因为saCas9的基因序列要比spCas9的基因序列短很多，所以在克隆方面， saCas9要更为容易，且saCas9更适宜包装成AAV病毒，当然两者都可以包装成腺病毒和慢病毒。 saCas9和spCas9另外一个很大的区别是两者识别的PAM序列不同， saCas9识别的PAM序列是5’-NNGRRT-3’,而spCas9识别的PAM序列为5’-NGG-3’,因为saCas9的PAM序列要比spCas9的PAM序列长，在基因组中出现的概率更低，相比于spCas9脱靶率要低，其gRNA设计也相对更困难。

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1. 服务项目全：维真生物可以提供从gRNA序列设计、gRNA质粒构建、高效gRNA序列筛选、病毒包装和细胞系建立等多种灵活性服务，以满足科研工作者不同的实验需求；
2. 服务种类多：维真生物可以提供单gRNA质粒构建，多合1 gRNA质粒构建和gRNA pool & gRNA mix质粒构建；
4 gRNA mix质粒构建特色！—— 保证有效 & 选择性多
该服务是将4条gRNA序列克隆至Cas9 + gRNA all in one慢病毒质粒。该重组质粒不仅可以用于转染细胞，也可包装成慢病毒。但是，考虑到重组载体比较大对细胞转录效率的影响，我们强烈推荐您直接选择慢病毒成品。
4 gRNA(for hAKT1) mix在HEK293中的敲除效果比较(左：测序结果；右：编辑效率)
gRNA pool质粒构建特色！—— 编辑效率大大提高
维真生物采用特殊的生产工艺针对同一基因构建gRNA pool质粒，大大提高了目的基因的编辑效率。
3. 质粒数量多：维真生物可以提供单载体、双载体；腺病毒载体、慢病毒载体和AAV 载体；不同报告基因EGFP和RFP ，不同真核抗性筛选基因puro和Blat、cre功能基因质粒。
示例：AAV常用载体：

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AAV常用载体
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