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《中国生物制品规程》 钩端螺旋体菌苗制造及检定规程

本品系用各地区主要的钩端螺旋体流行菌型，经培育、杀菌后，按型别配成单价或多价菌苗，用于预防钩映螺旋体病 。
[b]1　菌种[/b]
1.1　菌种来源
制造菌苗用之菌种，由中国药品生物制品检定所分发或经同意 。疫情需要时，新分离的菌种经与质量检定部门会同检定符合规程要求，并经中国药品生物制品检定所同意后方可用于生产 。
1.2　菌种检定 。
生产用的菌种应通过体重120～220g的豚鼠传代，2～3天后或濒死前抽取心血或摘取肝组织，接种生产用养基或其他适宜的培养基，并培育传至4代以上即可进行各项检定 。
1.2.1　培养特性
将上述菌种搁于生产培养基，接种量在5%以下，28～32℃培育5～10天，钩端螺旋体菌数应达每视野100条/400x以上 。培养物应透明，微带乳光，摇动时稍有云雾状混浊，菌形要求整齐，运动活泼，两端形成钩状 。
1.2.2　血清凝集反应
用3～10天的活培养物，每视野50～100条/400x，运动良好，且无自凝的钩端螺旋体，与特异性血清做定量凝集反应，其凝集效价应达血清原效价之半 。终点效价以菌数减少50%（++）为判定标准 。新菌种要求用凝集素交叉吸收试验法定型 。
1.2.3　毒力试验
用体重180～220g的健康豚鼠6只，分成两组，弱毒、强毒株分别各皮下注射培育5～10天，每视野50～100条/400x活培养物2ml 。弱毒株注射后48小时抽取心血，按1%量接种于生产培养基或其他适宜培养基2支，培育14天，镜检 。要求培育全部阳性，判为合格 。强毒株注射后，观察10天，至少应有2只豚鼠因患钩端螺旋体病死亡，判为合格 。
1.2.4　免疫力试验
用培育5～10天每视野70～100条/400x经56～58℃加温1小时或0.3%(ml/ml)苯酚杀死的钩端螺旋体培养物，以生理盐水做3倍稀释，免疫体重120～220g健康豚鼠3只（对照组3只应同时饲养），皮下免疫2次，第1次0.5ml，第2次1ml，间隔5天，末次注射后10～12天用同株或同型异株培育5～10天每视野50～100条/400x的培养物2ml进行皮下攻击 。
强毒株：攻击后观察10天，免疫组豚鼠应健存，外观及食欲正常，不耸毛，运动活泼，体重增加，解剖无黄疸 。对照组豚鼠至少应有2只患钩端螺旋体病死亡，判为合格 。
弱毒株：攻击后，24小时抽取心血，接种2管5%～8%兔血清培养基，每管1～2滴（约为1%接种量） 。培育14天 。免疫组心血培养要求2/3以上为阴性，对照组均为阳性，判为合格 。
1.2.5　抗原性试验
用培育5～10天每视野70～100条/400x经56℃加温1小时杀死的培养物，静脉免疫体重2.0～2.5kg的健康家兔3只，各按1ml、2ml与5ml，共注射3次，间隔5天，末次注射10～15天取家兔血清与同株培养物作凝集反应，至少应有2只家兔血清效价达到1∶10000以上判为合格 。
1.3　菌各保存
1.3.1　钩端螺旋体菌种应保存于含兔血清培养基或其他适宜培养基内，存放在18～22℃暗处，定期传代保存或液氮保存 。
1.3.2　为保存菌种的毒力及纯度，每传3～6代，应通过体重120～220g健康豚鼠一次，并同时做血清学特性检查 。
[b]2　菌苗制造[/b]
制造菌苗用的菌种每型可包括1～3株 。
2.1　菌种
用体重120～220g的健康豚鼠，皮下注射培育5～10天生长良好的种子培养物2ml，注射后2～3天或濒死前抽取心血或摘取肝组织，按1%以下量接种于生产用培养基或其他适宜的培养基，28～32℃培育7～18天，个别不易生长的菌种可延至30天，经检查为生长良好，运动活泼的纯培养，方可用于大量接种 。此外洗种法也可使用 。液氮保存菌种复苏后即可用于生产 。
第1代菌种须做纯菌试验及血清学特性检查 。前5代接种量均不应超过10% 。
制造菌苗所用之菌种不应低于4代（洗种法除外），最多不超过菌种检定许可的代数（从感染动物或复苏后接种第1代算起） 。
2.2　培育
2.2.1　生产用培养基可用综合或半综合培养基 。用10L大瓶或大罐通气培养时，经28～32℃培育5～14天，菌数应达300条/400x以上 。取样作纯菌试验及镜检，应无杂菌 。培养物可用适当的方法浓缩 。
2.2.2　培养物用苯酚或其他适宜杀菌剂杀菌 。苯酚含量为0.25%～0.35%(g/ml) 。
2.2.3　加苯酚的菌液于配合后，混匀，至少放置30分钟，取样镜检菌体灭活情况，测苯酚含量 。
大瓶培养应逐瓶做无菌试验 。
2.3　菌苗配制
2.3.1　杀菌后，按预定比例将不同菌型培养物混合成1批 。大罐培养亦可先合并后杀菌 。若移至大瓶存放，应按前、中、后抽样做无菌试验 。菌液如放置放半年以上 。合并前应逐瓶重做无菌试验 。
2.3.2　菌苗所含菌型应按当地主要流行菌型配合，5价以下（含5价）者，每型含菌数不低于1.5亿条/ml，各型配合比例，不应超过或低于计算量的10% 。六价以上菌苗，每型含菌数不应低于1亿条/m.l，但菌苗的总菌数不应超过12.5亿条/ml 。
2.3.3　菌苗中应加氯化钠，使其最后含量为0.75%～0.9%(g/ml) 。
2.4　菌苗分批
同日合并的菌苗作为1批 。大罐混合者，每罐作为1批，并按分装机分为亚批 。
2.5　分装
分装后按亚批抽样，送质量检定部门检定 。
[b]3　成品检定[/b]
3.1　物理化学检查
应为微带乳光的液体，不应变色，无异臭，无摇不散的凝块及异物 。PH值应为6.4～7.4 。氯化钠含量应为0.75%～0.9%（g/ml） 。苯酚含量不超过0.25%～0.35%(g/ml) 。
3.2　无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行 。
3.3　安全试验
3.3.1　防腐剂试验
用体重18～20g健康小白鼠2只，各皮下注射0.5ml，注射后战栗不得超过半小时，观察7天，应活存 。局部不得有脓肿或坏死 。
3.3.2　毒性试验
用体重18～20g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用体重350～450g之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗0.5ml，观察7日，应无死亡 。
3.4　免疫力试验
按成品菌苗所含菌型价数检定，用生理盐水将菌苗稀成每型含菌数0.5亿条/ml 。每生产年度生产前3批均匀应做免疫力试验，以后每5批至少抽检1批 。试验方法与判定标准同1.2.4项 。
3.5　鉴别试验
采用反向间接炭凝集试验，按成品菌苗所含菌型价数与相应炭血清做炭凝集试验，应产生特异性凝集 。
[b]4　保存与效期[/b]
应保存于2～8℃暗处，自杀菌之日起效期为1年半 。

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