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状态|如何摸索慢病毒最佳MOI值

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状态|如何摸索慢病毒最佳MOI值
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MOI （multiplicity of infection） ， 即感染复数 ， 指的是感染时病毒与细胞数量的比值 。 一般认为MOI是一个比值 ， 没有单位 ， 其实其隐含的单位是pfu number/cell 。 但对于某些病毒如AAV病毒 ， 无法用pfu表示病毒的数量 ， 而是采用TU、IU、病毒颗粒（viral particles, v.p）或基因组数量（vector genome,v.g.）来表示病毒数量 。
慢病毒（Lentivirus）载体是基于HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）的单链RNA病毒载体 ， 可感染分裂或非分裂细胞 ， 并将外源基因有效地整合到宿主染色体上 ， 且具有较低的免疫原性 ， 被广泛应用于各种体外细胞实验中 。
1. 常见细胞MOI参考值（慢病毒）

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2. 慢病毒MOI值摸索步骤
（1） 实验前信息准备
目标细胞系培养条件及增殖速度
排除细胞支原体污染
查阅文献 ， 获得目标细胞参考MOI值（如没有相关文献 ， 则可首先设置较大梯度的MOI进行预实验）
（2） MOI梯度设置
在查阅到的参考MOI值前后各设置2个梯度 ， 每个梯度至少相差2倍 ， 举例：查阅到某细胞系在文献中慢病毒MOI应用为10 ， 则设置MOI梯度为2.5-5-10-20-40 。

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根据公式计算所需添加的病毒量：
MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒体积（mL）/细胞个数
【状态|如何摸索慢病毒最佳MOI值】（3） 铺细胞
在96孔板中铺1×104个细胞/孔 ， 培养基定容至100μL/孔；
（4） 慢病毒感染
依据所计算出的病毒体积 ， 逐个孔添加慢病毒 ， 并于感染次日更换新鲜培养基 。
（5）确定MOI范围
a．带荧光标签的慢病毒：观察荧光
感染后72小时后 ， 于荧光显微镜下观察细胞状态和荧光情况 ， 确定细胞状态较好且荧光数较多的孔 ， 对应为较适宜的MOI值 。
b． 不带荧光标签的慢病毒：抗性筛选（puromycin/blasticidin等）
查阅相应抗性素在相应细胞株中的筛选浓度 ， 于感染后72小时加入药物 ， 培养3-5天 ， 镜下观察 ， 选取细胞存活率较高且细胞状态较好的孔 ， 对应为较适宜的MOI值 。
（6）缩小MOI范围进行二次摸索（附加步骤）
如需较为精确的MOI值 ， 可在步骤（5）中确定的MOI范围内再设置MOI梯度 ， 实验方法同步骤（3）—（5） 。 举例：

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3. 慢病毒感染中的常见问题
（1）怎样提高慢病毒的感染效率？
细胞良好的生长状态是达到高感染效率的保证 。 必要时可在感染时加入助感染试剂ADV-HR来提高慢病毒的感染效率 。
（2）助感染试剂ADV-HR的使用浓度和使用方法是什么？
助感染试剂ADV-HR能够显著提高慢病毒的感染效率 ， 并呈现剂量和时间依赖效应 。 但较高浓度的ADV-HR具有细胞毒性 ， 影响细胞状态和感染效率 。 我们建议您务必于目的细胞中进行ADV-HR浓度梯度预实验 。 我们在HEK293中的实验表明 ， 当ADV-HR使用浓度小于等于1.0×10-2mg/mL时 ， 细胞状态良好 。
（3）慢病毒感染后为什么细胞中出现大量黑点 ， 并影响细胞生长？
在排除细菌及真菌污染后 ， 细胞中的黑点通常为细胞碎片 ， 导致细胞破碎的原因有很多 ， 但在慢病毒感染后 ， 细胞破碎通常有两个原因：a. 慢病毒使用量过多 ， 或细胞数量过少；b. 支原体污染 。
由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖 ， 故支原体污染被许多实验室所忽略 。 但支原体易在病毒感染细胞后爆发 ， 故会出现大量细胞碎片 。 我们建议在使用病毒制品时 ， 应首先排除细胞、培养物及培养环境中的支原体污染 ， 以节约您的宝贵时间 。
（4）慢病毒应如何保存？
建议您于收货后第一时间分装 ， 并将病毒储存于液氮或-80℃ 。 切勿反复冻融！在未经冻融情况下 ， 持续-80℃储存环境可质保6个月 ， 超出该储存条件则需重新进行质控鉴定 。

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