重磅研究 | Cell：深入剖析遗传因素和微生物因素在宿主复杂行为中的作用( 二 )
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图1 孤立繁殖体系所得的Cntnap2-/-小鼠与其野生型相比存在社交能力缺陷、多动症及不同的肠道菌群结构 。 （A）孤立繁育体系（Cntnap2+/+：WT-I） 。 （B）实验设计 。 （C-D）动物三箱社交自由探索实验（每组n = 17; C, 社交能力: WT-I: t = 7.508, P< 0.0001; KO-I:t = 1.01, P = 0.6322; 两因素方差分析: F1,64= 21.11, P < 0.0001; D, 社交新奇偏好: WT-I: t = 6.386,P < 0.0001; KO-I: t = 0.2782, P > 0.9999; 两因素方差分析, F1,64= 18.65, P < 0.0001） 。 （E）社交互动实验（每组n = 15–16, Mann-Whitney U = 52.50, P = 0.0065） 。 （F-G）动物三箱社交自由探索实验的习惯阶段检测的自发活动程度（每组n = 17; (F), 总距离: WT-I vs. KO-I: Mann-Whitney U = 42, P = 0.0002; (G), 平均速度: WT-I vs. KO-I: Mann-Whitney U = 42.5, P = 0.0002） 。 （H）PCA分析肠道菌群β多样性（PERMANOVA: R2= 0.35732, P = 0.0002） 。 （I）ASVs系统发育树（内圈代表组间差异ASVs ， 绿色：KO中增加；白色：无差异；紫色：WT中增加 。 外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后结果 ， 白色：P ≥ 0.05；黑色：P < 0.05） ， 直方图为均值±标准误 。有学者认为只有使用同窝对照时所得的遗传突变表型差异证据才更为确凿 ， 因此 ， 我们通过Cntnap2-/+Cntnap2-/-（KO-L）和Cntnap2+/+（WT-L）小鼠重复上述实验 。 不出意外 ， KO-L小鼠依然存在显著的多动症表现（图2F-G） 。 但是令人惊讶的是 ， KO-L小鼠的社交行为是正常的（图2C-E） 。 不论是α多样性还是β多样性 ， 抑或是ASVs 或菌群代谢通路 ， KO-L小鼠肠道菌群结构与WT-L小鼠没有显著差异（图2H-I） 。 因此 ， 同窝出生的Cntnap2+/+小鼠比较存在多动症表型 ， 但是其社交能力及肠道菌群无显著差异 。
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图2 同窝繁殖体系所得的Cntnap2-/-小鼠与其野生型相比社交能力正常、肠道菌群结构相似 ， 但仍然存在多动症表现 。 （A）同窝繁育体系（Cntnap2+/+：WT-L） 。 （B）实验设计 。 （C-D）动物三箱社交自由探索实验（每组n = 14; C, 社交能力: WT-L: t = 5.856, P < 0.0001; KO-L: t = 7.849,P < 0.0001; 两因素方差分析: F1,52= 1.938, P < 0.1650; D, 社交新奇偏好: WT-L: t = 2.415,P = 0.0386; KO-L: t = 3.145, P = 0.0055; 两因素方差分析, F1,52= 0.266, P = 0.6082） 。 （E）社交互动实验（每组n = 16, Mann-Whitney U = 124, P = 0.897） 。 （F-G）动物三箱社交自由探索实验的习惯阶段检测的自发活动程度（每组n = 14; (F), 总距离: WTL vs. KO-L: Mann-Whitney U = 42, P = 0.0091; (G), 平均速度: WT-L vs. KO-L: Mann-Whitney U = 42.5, P = 0.0095） 。 （H）PCA分析肠道菌群β多样性（PERMANOVA:R2=0.04440, P = 0.26975） 。 （I）ASVs系统发育树（内圈代表组间差异ASVs ， 绿色：KO中增加；白色：无差异；紫色：WT中增加 。 外圈代表Benjamini-Hochberg FDR校正后结果 ， 白色： 2 在神经发育遗传缺陷的小鼠中 ， 肠道菌群选择性改变社交行为而非自发活动使用同窝对照时所得的遗传突变表型差异可以说是研究遗传易感性表型的金标准 ， 但是对于肠道菌群而言 ， 同窝饲养本身就可能导致菌群改变从而掩盖了菌群对行为的影响 。 通过上述研究我们假设 ， 社交行为表型是由肠道菌群导致而自发活动表型是由遗传因素（即Cntnap2敲除）所导致的 。 为了验证该假设 ， 我们进行了下面三个实验 。 1）将KO-I小鼠和WT-I小鼠同笼饲养；2）将原来同笼饲养的WT-L和KO-L小鼠分笼饲养；3）将上述四组小鼠（KO-I ， KO-L ， WT-I ， WT-L）的肠道微生物通过粪菌移植（FMT）的方法移植给无菌小鼠（GF） 。 对于同笼饲养的KO-I小鼠和WT-I小鼠（图3A-B） ， 他们的肠道菌群可以相互影响最终趋于一致 。 我们发现同笼饲养的KO-I小鼠和WT-I小鼠菌群结构相似 ， 不存在显著不同的ASVs 或菌群代谢通路（图3I） ， 组间α多样性（菌群丰度）和β多样性（PCA分析）差异（PERMANOVA R2= 0.11, P = 0.044）较孤立繁育的KO-I小鼠和WT-I小鼠组间的差异小（PERMANOVA R2= 0.36, P = 0.0002） 。 重要的是 ， 同笼饲养的KO-I小鼠社交行为恢复正常（图3C-E）但是仍然存在多动症行为（图3F-G） 。 将原来同笼饲养的WT-L和KO-L小鼠分笼饲养并繁育得到的下一代（WT-T和KO-T ， 图4A-B） ， 我们发现KO-T小鼠虽然社交能力正常 ， 但是社交新奇偏好显著降低（图4C-D） ， 该指标与ASDs症状密切相关 ， 因此我们认为KO-T 小鼠存在社交缺陷 。 此外 ， KO-T 小鼠较WT-T小鼠多动症行为更明显（图4F-G） 。 KO-T小鼠肠道菌群与WT-T存在显著差异（图4H-I） ， 表现在他们间有73个差异ASVs和44个微生物代谢通路不同 。 因此 ， 该实验证明分笼饲养负向调节了KO小鼠的社交行为并且改变其菌群结构 ， 但是对于多动症行为没有显著影响 。 最后 ， 为了排除亲代饲养及其他变量对行为的影响 ， 并且分析菌群改变对Cntnap2-/-小鼠行为影响的因果关系 ， 我们将WT-I、KO-I、WT-L、KO-I组小鼠的肠道菌群通过粪菌移植的方法移植给无菌（GF）小鼠（图5A） 。 同其他无菌动物粪菌移植试验一样 ， 粪菌移植后各组的菌群很大程度上保持了所移植的菌群特征（图S3） 。 与其他研究一致 ， GF小鼠的行为学表现为社交能力缺陷和较高社交新奇偏好的特点 。 不同组粪菌移植后的GF小鼠与其所移植粪便来源的小鼠表现出几乎相同的行为 。 移植WT小鼠来源的粪便后（GF：WT-I ， GF：WT-L） ， GF小鼠的社交能力缺陷均有所改善（图5B-C） 。 对于移植了KO小鼠来源粪便的GF ， 仅KO-L组粪菌移植的GF小鼠（GF：KO-L）社交障碍得到了改善 ， KO-I组粪菌移植GF小鼠（GF：KO-I）社交障碍依然存在（图5B-C） 。 因此 ， 这些数据证实KO-I组小鼠可能缺少一些对于社交行为至关重要的一种或几种肠道细菌 。 因为FMT并没有改变移植后GF小鼠的多动症（图5D-E） ， 所以本研究结果证明-/-小鼠的社会缺陷是由微生物组的改变导致的 。
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