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专家论坛｜尹明：HBV感染的动物模型研究进展

HBV是一种嗜肝的DNA病毒 ， 会引起人类急性或慢性肝炎 。 慢性乙型肝炎(CHB)是导致肝纤维化、肝硬化和肝癌的重要原因[1]1965年 ， Blumberg等[2]在澳大利亚土著人检测到HBsAg ， 称为“澳大利亚抗原” 。 1970年 ， Dane等[3]通过电镜检测到HBV完整的病毒颗粒 ， 称为“丹氏颗粒” 。 HBV有严格的种属特异性 ， 它的自然宿主限制在人类和非人灵长类动物身上 ， 包括黑猩猩(chimpanzees)、大猩猩(gorillas)、长臂猿(gibbons)和猩猩(orangutans) 。 这些非人灵长类动物的研究 ， 受到伦理和饲养等限制 ， 只有很少的实验室有条件开展 ， 并且黑猩猩在欧洲已被禁止用于实验研究[4] 。 直到2012年 ， 李文辉团队[5]发现HBV感染肝细胞的关键受体 ， 是钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)；稳定表达人NTCP的HepG2细胞系(HepG2-NTCP ， 自然状态下HepG2不能感染HBV)可以感染HBV 。 2016年 ， Lempp等[6]发现 ， 小鼠肝细胞转入人NTCP后可以支持HBV的进入 ， 但不能转录、翻译和形成共价闭合环状DNA(cccDNA) 。 2017年 ， Lempp等[7]将食蟹猴、恒河猴和猪的肝细胞表达hNTCP ， 这些细胞变得HBV易感 ， 效率与人肝细胞相当 。 以上研究表明 ， 不同物种间的差异 ， 如肝细胞的结构、微环境和(共)受体 ， 或者血液中的可溶性因子 ， 影响了HBV的易感性和感染效率 。 这也从侧面表明 ， HBV侵入、修复、cccDNA形成(非必须)、转录、复制、组装、释放、慢性感染和再复发机制的复杂性 ， 特别是还未弄清楚造成物种间差异的原因 ， 需要进行更深入的基础研究 。 目前CHB抗病毒治疗通过口服核苷(酸)类似物(NUCs)可抑制HBV复制 ， 安全性高 ， 但很少发生HBsAg清除及血清学转换 ， 停药无期；只能在不到10%的CHB患者中实现“功能性治愈” 。 皮下注射聚乙二醇干扰素α(PEG-IFNα)可使10%~30%的患者清除HBeAg ， 并发生HBsAg血清学转换 ， 兼具免疫调节特性；但耐受性差 ， 存在不良反应[8] 。 在研的抗HBV药物或者疗法分为两类：(1)抑制或者沉默病毒的复制 ， 如HBV进入抑制剂、cccDNA及其转录活性抑制剂、基因表达抑制剂、核衣壳组装和pgRNA包装抑制剂、HBsAg分泌抑制剂、RNAi和Crispr/Cas技术敲除等；(2)激活或者诱导免疫反应 ， 如免疫调节剂、干扰素、Toll样(病原体识别受体)受体激动剂、免疫检查点调节剂、治疗性疫苗和改造HBV特异性T淋巴细胞等[8-9] 。 理想的临床前动物模型既需要模型中有较高的HBV病毒含量 ， 也需要相应的免疫环境 。 遗憾的是 ， 至今还没有建立一个有效的模型 ， 能够真实地再现HBV感染的免疫和发病机制 。 由于鸭子、土拨鼠和树鼩是非标准化的实验动物[4] ， 而hNTCP转基因的食蟹猴、恒河猴和猪等模型还没有成功的报道 ， 本文主要综述小鼠HBV模型的最新进展(表 1) ， 为临床前HBV药效实验和HBV相关研究提供参考 。

专家论坛｜尹明：HBV感染的动物模型研究进展
本文插图


1HBV转基因小鼠模型
在HBV启动子或者小鼠肝细胞特异启动子(如白蛋白启动子Alb)的控制下 ， 将编码HBV蛋白的基因序列通过原核注射转入到小鼠中 ， 获得表达HBV蛋白的转基因小鼠 ， 如病毒包膜(envelope ， S基因)[10-12]、核心(core ， C基因)[13]、前核心(precore ， preC基因)[14]和X基因[15-16] 。 这些模型对HBV的特性验证提供了重要的数据支持 。 随后 ， 有两个研究小组[17-18]用全长或者超长的HBV全基因序列制成转基因小鼠 ， 然而仅在少数转基因小鼠的器官中检测到病毒复制和蛋白表达 ， 其血清中病毒的滴度很低 。 在乙型肝炎抗病毒药物筛选方面应用较多的转基因小鼠模型是Guidotti等[19]研发的 ， 其在HBV全长序列5′末端重复一个C基因和X基因及其增强子 ， 构建了1.3倍全长HBV基因组的转基因小鼠 。 该小鼠血清中可检测到HBsAg、HBeAg和HBcAg ， 在小鼠体内也检测到完整病毒颗粒的形成 ， 且病毒颗粒具有感染性 。 该转基因小鼠肝脏和肾脏中有高水平的HBV表达 ， 外周血清中的HBV DNA拷贝数高达107 IU/ml ， 其HBV抗原转录水平与CHB患者相当 ， 已经成功用于HBV合成、转录 ， 病毒组装和成熟的病毒分泌等抑制药物的药效实验[20-22] 。 然而 ， 由于转基因模型中HBV整合在小鼠基因组上 ， 是组成型表达(在胚胎期即表达) ， 因而对HBV有天然的免疫耐受性 ， 不适宜于进行免疫病理学方面的研究 。 另外 ， HBV转基因小鼠中包含了rcDNA(relaxed circular DNA)合成、转录 ， 病毒组装及成熟的病毒分泌 ， 但未检测到cccDNA形成 ， 尚不清楚不能形成cccDNA的原因[23] 。 为了解决HBV抗原免疫耐受的问题 ， 王军等[1]综述了不同的方案 ， 比如用HBV转基因小鼠与免疫缺陷小鼠(如SCID、TCRα-/- ， 和RAG1-/-等)杂交 ， 构建了免疫缺陷背景的HBV转基因小鼠 。 这些小鼠缺失T和B淋巴细胞 ， 给该小鼠过继输入相同遗传背景的野生型小鼠脾脏细胞(T和B淋巴细胞) ， 使表达HBV的小鼠肝脏细胞暴露在重建的免疫系统中 ， 得到了类似于人类的HBV感染模型 ， 但其操作过程比较复杂 ， 且与人类感染HBV后引起肝脏炎症的自然病程相比仍有较大差别 ， 表明鼠肝脏中存在与人肝脏细胞不同的特征 ， 如存在不易感HBV的微环境或者结构等 。 另一种解决HBV抗原免疫耐受问题的方法是通过基因表达调控系统 ， 如Tet-on系统 ， 在特定的时间及部位(肝脏)诱导HBV基因表达 ， 但该类模型同样存在肝炎特征与人类肝炎差别较大的问题 。 2HDI小鼠模型

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