维真生物助力
病毒产品：AAV Ctrl & AAV-MCL-1
注射动物：6月龄雄性转基因APP/PS1 (C57BL/6)小鼠
病毒用量：1.5 μL （0.15 μL/min）
注射方式：立体定位注射
注射部位：海马区
检测时间：30天后
作者以阿尔兹海默症转基因小鼠模型APP/PS1为研究对象 ， 将AAV-MCL-1过表达载体注射至小鼠的海马区 ， 结果显示 ， 过表达MCL-1基因能显著改善APP/PS1小鼠的认知功能 ， 而且海马区细胞外的Aβ斑块出现减少 。 此外 ， MCL-1的过表达也提高了野生型小鼠的学习和记忆能力 ， 这表明MCL-1能在神经元中发挥非常重要的作用 。
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研究背景
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease， AD）是一种由神经元死亡而造成的神经变性疾病——以进行性记忆力减退和获得性知识丧失 ， 直至日常生活活动能力完全丧失为特征 ， 给社会和家庭带来沉重负担 ， 成为严重的社会和医疗卫生问题 。 阿尔茨海默病是继心血管病、脑血管病和肿瘤之后 ， 威胁老年人健康的重要疾病 。 目前 ， 全球约有5000万人罹患阿尔兹海默症 。 预计到2050年 ， 这个数字将增加至1.52 亿 。 当前 ， 全球每年用于治疗、护理阿尔兹海默症病人的费用已经达到1万亿美元 ， 而这一数字将在2030年达到目前的两倍 。
阿尔茨海默病的病因复杂 ， 目前主流观点认为是由β淀粉样蛋白（Aβ）和微管相关蛋白Tau沉积造成神经元大量死亡引发的 ， 1998年以来 ， 有100余种治疗此病的药物进行临床试验 ， 但仅有6种针对此病症的药物获得FDA的批准上市 ， 而且近年来世界各大制药公司针对Aβ或Tau蛋白开发的药物均遭到了不同程度的失败 ， 这给人类对于AD的攻克埋上了一层巨大的阴影 。
线粒体功能障碍是AD的一个基本病理特征 ， 在散发性和家族性AD病例以及AD动物模型中 ， 均被发现有受损的神经元线粒体的积累 。 功能受损的线粒体会触发能量应激 ， 从而促进Aβ寡聚化和Tau过度磷酸化 。 线粒体合成调节因子PGC-1α的表达变化以及线粒体功能失调导致的钙稳态失衡都已被证实与AD的发生有关 。 新的研究表明 ， AD患者的脑细胞中线粒体自噬受到损害 ， 能造成大量损伤性线粒体积累 ， 导致突触功能障碍和认知功能的下降 。 因此 ， 保障AD患者神经细胞中线粒体自噬的正常进行至关重要 ， 而找到一种诱导线粒体自噬的药物靶点则是重中之重 。
近期 ， 浙江大学基础医学院夏宏光教授团队在《Nature communications 》（IF=12.121）上在线发表了一篇关于阿尔茨海默病的最新研究成果—Pharmacological targeting of MCL-1 promotes mitophagy and improves disease pathologies in an Alzheimer’s disease mouse model 。 该研究首次揭示了抗凋亡蛋白MCL-1作为线粒体自噬受体蛋白介导线粒体自噬的新机制 ， MCL-1的特异性抑制剂UMI-77可以在AD模型小鼠中显著缓解阿尔茨海默病的病理特征 ， 改善小鼠认知；本研究提出靶向MCL-1蛋白诱导线粒体自噬是一种有巨大前景的治疗阿尔茨海默症的策略 。
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【蛋白|更进一步！！解密阿尔茨海默病治疗新靶点！】 UMI-77作用机制示意图
研究结果
首先 ， 研究人员通过利用荧光蛋白Keima构建敏感的线粒体自噬定量检测方法 ， 对稳定表达mt-Keima（Keima蛋白具有在酸性和中性pH中荧光信号不同的特性 ， 定位于线粒体中的Keima（mt-Keima）可显示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体 ， 直观地反映线粒体自噬程度）的HEK293T细胞系和一个包含2024个FDA批准的药物或候选药物库进行小分子化合物高通量筛选 ， 找到了一种可以安全有效诱导线粒体自噬的小分子化合物——UMI-77 ， 一种Bcl-2家族抑制剂 。
研究表明 ， UMI-77是抗凋亡蛋白MCL-1的特异性抑制剂 ， 能阻断MCL-1和Bax/Bak之间的相互作用 ， 从而允许Bax/Bak诱导细胞凋亡 。 研究者通过测定线粒体的去极化及自噬水平 ， 发现与CCCP(氧化磷酸化抑制剂 ， 影响线粒体的蛋白合成)相比 ， UMI-77在亚致死剂量下不会诱导HEK293T和HeLa细胞的线粒体损伤；在HEK293T-mt-Keima中 ， UMI-77+CCCP联合使用明显增强了线粒体的自噬水平 ， 表明UMI-77不会造成线粒体损伤 ， 且能够促进线粒体自噬 ， 且能增强CCCP诱导的线粒体损伤引发的线粒体自噬 。 HEK293T-mt-Keima细胞的活细胞成像实验、透射电子显微镜（TEM）观察及western bloting 实验也证实了UMI-77的促线粒体自噬作用 。
为排除凋亡诱导剂对线粒体自噬可能的影响 ， 研究者又做了评估实验 。 结果发现 ， 药物库中大多数诱导细胞凋亡的药物及pan-caspase抑制剂Z-VAD-fmk（可阻断细胞凋亡）不会影响UMI-77的促线粒体自噬作用 ， 这表明UMI-77诱导的线粒体自噬 ， 不依赖于凋亡诱导 ， 且UMI-77在亚致死剂量下不会诱导细胞凋亡 。 与此同时 ， UMI-77处理后 ， 巨自噬标记物p62和其他细胞器标记物的表达水平并没有下降 ， 这表明UMI-77可特异性诱导线粒体自噬 ， 不影响非选择性自噬 。
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图1. UMI-77可特异性诱导线粒体自噬
既然UMI-77能诱导线粒体自噬 ， MCL-1又是UMI-77的靶点 ， 那么MCL-1是否参与了UMI-77诱导的线粒体自噬的过程呢？研究者对此进行了探索 ， 发现在HEK293T和HeLa细胞中敲除MCL-1基因后减缓了UMI-77诱导的线粒体蛋白Tom20和Tim23的降解 ， 抑制了UMI-77诱导的线粒体自噬水平 ， 这说明MCL-1在UMI-77诱导的线粒体自噬激活中是必须的 。
此前已有研究证明 ， 细胞自噬受体如FUNDC1和FKBP8的过表达能促进细胞自噬 ， 那么MCL-1在线粒体自噬中是否也是扮演自噬受体的角色？为了探究其在自噬中所起的作用 ， 研究者建立强力霉素Dox诱导的MCL-1过表达的HEK293T稳定细胞系（HEK293T- MF2） ， 值得注意的是 ， HEK293T- MF2中线粒体标志物Tim23的表达水平下降 ， 线粒体变小、片段化 ， 而且线粒体和溶酶体出现了共定位 。 透射电镜分析也证实了MCL-1的过表达促进了线粒体自噬 。 综上结果表明 ， MCL-1在线粒体自噬中发挥关键作用 。
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图2. MCL-1促进线粒体自噬
研究者对MCL-1在线粒体自噬中是否扮演自噬受体的角色继续展开研究 ， 并推测UMI-77诱导Bax/Bak中MCL-1释放后能MCL-1能与LC3发生相互作用 ， 从而促进线粒体自噬 。 研究发现MCL-1在其C端有三个“LC3-相互作用区（LIR）”基序 ， 其中前两个基序LIR261-264和LIR318-321位于胞质区 ， 并且LIR261-264具有很强的保守性 ， 这提示它是有一定功能的 。
研究人员首先验证了UMI-77是否能诱导MCL-1和LC3发生相互作用 ， 通过免疫共沉淀试验发现 ， 经UMI-77处理后 ， LC3A与MCL-1的相互作用增强 ， 而Bax与MCL-1的相互作用随之减弱；在UMI-77的作用下 ， MCL-1还与其他Atg8家族蛋白相互作用 。 此外 ， pull-down实验也显示MCL-1能直接与LC3A结合 。 随后 ， 研究者又生成了一系列MCL-1 LIR261-264和LIR318 - 321基序的突变体 ， 结果显示MCL-1 LIR261-264基序突变后减弱了MCL-1与LC3A的相互作用 。
接下来 ， 研究者对UMI-77是否能增强内源性MCL-1和LC3A的相互作用展开了相关研究：结果与我们预期一致 ， 发现用UMI-77处理后 ， Duolink?PLA结果显示 ， 在线粒体上能观察到内源性MCL-1和LC3A相互作用的增强 ， 而未用UMI-77处理时这种相互作用也能观察到 ， 反映了基础内源自噬的水平 。 这个结果进一步表明MCL-1是一个重要的线粒体自噬受体 。
最后 ， 作者又验证了MCL-1和LC3A的相互作用是否能在UMI-77介导的线粒体自噬激活中起作用 。 结果显示 ， 敲除MCL-1后 ， HEK293T-mt-Keima和SH-SY5Y细胞中UMI-77介导的线粒体自噬水平降低 ， 而补充MCL-1/LIR318-321突变体MCL-1的表达可逆转此现象 。
综上所述 ， MCL-1是一个线粒体自噬受体 ， 它通过其LIR261-264基序与LC3A直接作用 ， 并且这种相互作用能被UMI-77增强进而导致线粒体自噬水平的增强 。 此外 ， MCL-1和LC3A之间的相互作用是UMI-77介导线粒体自噬激活的关键 。
图3. MIC-1和LC3A的相互作用是UMI -77诱导线粒体自噬所必需的
随后 ， 作者研究了其他线粒体自噬受体蛋白是否在UMI-77诱导的线粒体自噬或MCL-1-LC3A相互作用的诱导中发挥作用 。 作者以野生型HeLa细胞和四基因敲除的突变体HeLa细胞（敲除线粒体自噬受体NDP52、p62、NBR1和TAX1BP1）为研究对象进行研究 ， 发现UMI-77能显著增强MCL-1和LC3A之间的相互作用 ， 线粒体标记蛋白Cox II和Tim23的表达水平也均呈现时间依赖性的降低 ， 此外 ， 线粒体自噬受体（FUNDC1, BNIP3和NIX）也被证明不参与UMI-77诱导的线粒体自噬 ， 表明UMI-77诱导的线粒体自噬与这些线粒体自噬受体蛋白无关 。
鉴于UMI-77阻断了MCL-1与Bax的相互作用 ， 研究者随后分析了Bax在UMI-77诱导的线粒体自噬中的作用 ， 令人惊讶的是 ， 敲低Bax后UMI-77诱导的线粒体自噬水平增强 ， 说明Bax不参与UMI-77诱导的线粒体自噬 。 另外两种MCL-1相互作用蛋白Beclin1和Parkin也先后被排除参与UMI-77介导线粒体自噬激活的可能性 。 相反 ， 在HEK293T-mt-Keima细胞或MEF细胞中敲除ATG5后抑制了Tom20和Tim23降解 ， 说明ATG5是UMI-77诱导线粒体自噬必需的 。
综上结果表明 ， UMI-77诱导的线粒体自噬是通过ATG5自噬通路介导的 ， 不依赖于线粒体自噬受体蛋白NBR1、TAX1BP1、p62、NDP52、FUNDC1、BNIP3、NIX以及MCL-1相互作用蛋白Bax、Beclin1和Parkin 。
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图4. UMI-77以ATG5依赖的方式诱导线粒体自噬
接着 ， 研究者又研究了MCL-1作为线粒体自噬受体的生理功能 。 研究表明 ， OGD（氧-糖剥夺）或OGD/再灌注会损伤线粒体 ， 并通过线粒体自噬诱导清除受损线粒体 。 mt-Keima实验结果显示 ， 敲除MCL-1后OGD诱导的线粒体自噬水平显著降低 ， 线粒体标记蛋白Cox II和Tim23的特异性降解也被抑制 ， 说明MCL-1对OGD诱导的线粒体自噬是必需的 。
已有研究证明MCL-1可调节线粒体的碎片化 ， 因此研究人员试图了解MCL-1在OGD诱导的线粒体自噬中的作用 。 免疫荧光显微镜观察到OGD处理后HEK293T细胞线粒体碎裂 ， 而敲除MCL-1改变了这些形态学变化 ， 表明MCL-1在OGD诱导的线粒体碎片化中起着关键作用 ， 并且MCL-1 LIR261-264基序仅参与线粒体自噬 ， 而不参与MCL-1的线粒体碎片化调节作用 。 同样地 ， OGD也增强了MCL-1与LC3A的相互作用 ， 降低了其与Bax的相互作用 ， 再次证明MCL-1是一种线粒体自噬激活的受体 。
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图5. MCL-1是OGD诱导的线粒体自噬所必需的
接着 ， 研究人员探究了UMI-77诱导的线粒体自噬对AD模型APP/PS1小鼠疾病病理和行为表型的影响 。 对4月龄的小鼠腹腔注射10 mg/kg剂量的UMI-77 ， 共持续4个月 。 通过Morris水迷宫测试发现UMI-77治疗明显改善了APP/PS1小鼠的学习和记忆能力 ， 且能有效降低小鼠脑内不溶性Aβ1-42的水平 。 同样 ， 免疫荧光结果也显示UMI-77治疗后海马区细胞外Aβ斑块明显缩小 ， 星形胶质细胞的激活也受到抑制 。 此外 ， UMI-77也降低了APP/PS1小鼠的神经炎症水平 ， 表现为炎症细胞因子（TNFα和IL-6）水平显著降低 。 重要的是 ， UMI-77显著恢复了神经元的线粒体形态 ， 这一研究结果与在APP/PS1小鼠中观察到的通过UMI-77可以诱导线粒体自噬从而清楚受损线粒体相一致 。 这些结果均表明UMI-77是一种治疗AD的有效药物 。
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最后 ， 研究人员评估了MCL-1介导的线粒体自噬对APP/PS1小鼠行为表型的影响 。 将AAV-MCL-1过表达载体注射小鼠的海马区 ， MCL-1的过表达显著改善了APP/PS1小鼠的认知功能 ， 并减少了海马区细胞外的Aβ斑块 。 令人惊讶的是 ， MCL-1的过表达也提高了野生型小鼠的学习和记忆能力 ， 表明MCL-1在神经元中有非常重要的作用 。
综上所述 ， MCL-1是一种新的线粒体自噬受体蛋白 ， 是治疗阿尔茨海默症的新药物靶点；UMI-77可以通过释放游离的MCL-1蛋白诱导线粒体自噬 ， 显著恢复APP/PS1 AD小鼠模型的认知功能缺损 ， 减轻炎症反应和Aβ斑块引起的病理效应 ， 促进受损线粒体的清除 。 总而言之 ， 诱导线粒体自噬是治疗阿尔茨海默症的有效策略 。
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