知识科普|【维真生物-慢病毒包装】慢病毒包装原理及步骤( 二 ) 生物|细胞|整合|纯化|包装|di

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慢病毒包装流程维真生物可以提供从LV质粒构建至病毒包装的所有服务外包项目。而且，维真生物全套的LV载体和表达系统可用于体内和体外表达human/mouse/rat ORFs ， lncRNA ， circRNA ， shRNAs和CRISPR/gRNA 。下面是LV从头合成的流程：

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慢病毒纯化维真生物采用蔗糖密度梯度超速离心法对LV病毒进行纯化。它利用不同颗粒之间存在的沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。下图是LV病毒纯化的示意图：

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慢病毒滴度检测维真生物的LV病毒采用孔稀释法进行标定。
孔稀释法是通过数荧光的方法测定慢病毒滴度，得到的结果为有感染能力的慢病毒颗粒数。下图是维真某慢病毒(3.20×108TU/mL)孔稀释法测滴度时的荧光图：

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维真生物采用2代慢病毒包装系统来制备慢病毒。该系统为三质粒系统，包括1个包装质粒(psPAX2)、1 个包膜质粒(pMD2G)、1个目的基因质粒和1株包装细胞(293T cell) 。下图是慢病毒制备流程示意图：
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1. 重组慢病毒的制备 Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs ，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~ 1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。
Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；
2)按照以下比例配制转染试剂：
Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μg
Mix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min ，加入至15cm dish中。（细胞达到汇合度90% ，细胞过少会影响转染效率）
Day3:6h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。
Day5:72h观察细胞状态并拍照。收取上清培养基，过0.45μm滤膜，上清培养基加入超速离心管中，配平后离心， 25000rpm ， 4℃离心1.5h 。弃上清，用适当病毒保存液回溶混匀溶解过夜。
Day6：收集病毒分装，进行病毒滴度测定。
2. 重组慢病毒滴度测定 2.1 整合数法标定不带荧光的重组慢病毒滴度
2.1.1 病毒感染细胞
①感染前6 h 在24孔细胞培养板中以2.5×105个细胞/孔均匀接种HEK293细胞。

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