治疗|【推荐】NEPA21-让Crispr-Cas9基因编辑技术与类器官培养研究如虎添翼的利器
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类器官:
类器官（Organoids） ， 是指利用成体干细胞（ESCs）或诱导式多能干细胞（iPSCs）进行体外三维（3D）培育的具有一定空间结构的组织类似物 。 类器官能高度模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养 。 类器官模型是介于细胞系和动物模型之间的一种新型功能化体外模型 ， 可用于解析遗传发育、建立疾病模型、筛选药物和检测毒性以及探索个性化医疗方案 。 迄今为止世界各国科学家陆续培养出脑、肝、胃、肺、肠、肾脏和胰腺等各种类器官 。
2013年 ， 类器官技术被《Science》评为十大科技突破之一 ， 2017年 ， 又被《Nature Methods》评为生命科学领域的年度技术（Method of the Year 2017） 。
荷兰科学家Hans Clevers教授是类器官研究领域国际公认的先驱和鼻祖 ， 早在2009年 ， Hans Clevers就发现Lgr5蛋白是肠道干细胞的标志物 ， 并成功建立了首个肠道干细胞体外3D类器官培养体系 ， 开创了类器官作为疾病模型的研究时代 。
目前 ， 类器官在生命科学研究中应用广泛 ， 通过改变不同类器官的基因可以极大地帮助研究生物学过程和疾病建模 。 然而 ， 由于缺乏简单的基因组工程方法 ， 基因组编辑人类类器官的构建比较困难 。
CRISPR/Cas9是进行基因编辑的强大工具 ， 可以对基因进行定点的精确编辑 。 在向导RNA（guide RNA ， gRNA）和Cas9蛋白的参与下 ， 待编辑的细胞基因组DNA可被看作病毒或外源DNA ， 得到精确编辑 。
在2020年3月份 ， Hans Clevers研究团队在《Nature Cell Biology》杂志上发表学术论文《Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing》 。
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其利用非同源依赖的CRISPR-Cas9技术 ， 可快速高效地对人源类器官进行基因敲入 ， 他们将该技术命名为CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis) ， 为人源类器官的内源基因敲入提供了重要的工具平台 。
研究人员利用这种新方法分析了肝细胞如何分裂以及DNA过多异常肝细胞是如何出现的 ， 并发现敲除癌症基因TP53 ， 异常肝细胞的非结构化分裂会更频繁 。 以上发现或有助于深入研究相关癌症的发展过程 。
研究者们为了印证CRISPR–HOT技术在人源类器官中进行基因敲入的方法可行 ， 首先在两种难以转染的人源类器官（肝脏导管类器官及肝细胞类器官）进行测试 ， 并对两种不同介导方式的基因敲入技术产生的类器官进行对比分析 。
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图示： HDR与NHEJ的技术路线以及优劣比较
结果发现 ， 虽然抑制TP53的活性之后 ， HDR介导的基因敲入方式的效率略有提高 ， 但仍然比NHEJ介导的基因编辑效率要低 。 Hans Clevers研究组的工作用CRISPR-HOT方法 ， 建立了不依赖于对TP53活性抑制的以NHEJ介导的基因编辑技术 ， 简化了基因敲入的流程 ， 对于肝细胞等成体干细胞来源的类器官可视化研究提供了可靠的基因编辑方式 。
2020年11月 ， Hans Clevers研究团队又在《Nature Protocols》杂志发表学术论文《Establishment of human fetal hepatocyte organoids and CRISPR–Cas9-based gene knockin and knockout in organoid cultures from human liver》 ， 阐述利用CRISPR/Cas9基因编辑技术探究人类胎儿肝细胞作为类器官长期扩增的培养条件 。
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在文章中 ， 作者提出：针对人类胎儿肝细胞和人类肝导管类器官的基因组编辑需要两种不同的实验程序 。 对于人类胎儿肝细胞类器官 ， 采用基于电转杯电转染的转染策略 。 为此 ， 类器官必须分解成单细胞或小块细胞 ， 建议从第5代及以后开始对肝细胞类器官进行基因组工程设计 ， 肝细胞类器官电穿孔的能力通常不会随时间而降低 ， 作者已经成功地对人胎儿肝细胞类器官进行了基因组工程 ， 可以做到至少第50代为止 。
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图示：人类胎儿肝细胞类器官的基因组工程技术概略图(采用电转杯电转染)
相反 ， 对于人肝导管类器官 ， 转染步骤是对完整的类器官进行的 ， 是一种离体组织电转染的方式 。
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图示：人类肝脏导管类器官的基因组工程技术概略图(采用离体组织电转染)
另外针对不同的基因编辑方式（Knock in和Knock out） ， 作者也分享了非常详细的应对策略（见下图） 。
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俗话说 ， 工欲善其事 ， 必先利其器 。 那么在Hans Clevers研究团队深耕的类器官领域中 ， 属于他们的一把利器是什么呢？我们发现 ， 在大牛们的研究过程当中 ， 对细胞的转染操作贯穿其中 。 而NEPA GENE的NEPA21基因高效转染系统正是他们所选用的高效电转仪 。
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NEPA21 基本介绍
【1】采用全新设计的电转程序 ， 电压衰减（Voltage Decay）模式；基因导入+反向导入模式 。
【2】不需要特殊转染试剂辅助 ， 节省实验成本；电转程序中的各项参数实时可见、可调 ， 特别适用于优化原代细胞、非常见细胞的电转参数 。
配件介绍
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【治疗|【推荐】NEPA21-让Crispr-Cas9基因编辑技术与类器官培养研究如虎添翼的利器】
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NEPA21高效基因转染系统独有的电压衰减（Voltage Decay）设计 ， 可在获得高转染效率的同时 ， 提高细胞存活率 。 专门针对难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵以及宫内胚胎等转染 。
得益于NEPA21良好的应用体验 ， Hans Clevers利用其已在类器官领域取得了丰硕的研究成果 。 目前已有多篇应用文献 ， 是Crispr/Cas9基因编辑的第一品牌电转系统 。 NEPE21——让细胞转染更简单、更Free 。
TO—公司介绍：
广州市艾贝泰生物科技有限公司 ， 专注于为生物医药行业提供生物工艺解决方案；为 细胞存储、细胞治疗技术研发、应用研究等不同领域推出针对性应用技术的 细胞治疗平台。 作为整体解决方案供应商 ， 艾贝泰自2009年成立以来 ， 一直力求为客户提供一站式的优质服务 。
产品已涵盖冷冻存储、基因编辑、克隆筛选、生化分析、过程控制、细胞培养和样本处理等细胞治疗的全过程应用 。 在广州、北京、上海、成都、西安等地设立办事处 ， 业务范围覆盖全国 ， 秉承“技术专业、服务周到、行动快速”的服务宗旨 ， 以客户为导向 ， 与技术伙伴紧密合作 ， 共同为中国生物制药产业的发展保驾护航！
参考文献：
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