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【维真生物】提供现货产品、载体构建、病毒包装、细胞系建立等服务
实验原理
真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内 ， 制备DNA将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离 ， 同时保持DNA分子的完整 。 提取DNA的过程是指将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质 ， 再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质 ， 得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出 。 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性 。
在提取DNA的反应体系中 ， SDS用于细胞膜、核膜 ， 并使组织蛋白与DNA分离 ， EDTA则抑制细胞中Dnase活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸 ， 使起与DNA分子分离开来 。
实验材料
（1）细胞裂解缓冲液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L ；EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L； NaCL 20 mmol/L； SDS 10% ；胰RNA酶 20ug/ml 。
（2）蛋白酶K： 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中 ， 用一次性过滤器过滤除菌 ， -20℃备用 。
（3）TE缓冲液（pH 8.0） ， 高压灭菌后室温贮存 。
（4）酚：氯仿：异戊醇=25:24:1（体积比） 。
（5）NaAc 3 mol／L 。
（6）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水 。
实验过程
1、取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3） ， 尽量剪碎 。 放入匀浆器中 ， 加入2ml细胞裂解缓冲液 ， 然后充分研磨 ， 至不见明显组织块 ， 然后转入1.5ml 离心管中 ， 以12000 rpm离心5min 。
2、弃掉上清 ， 加入0.4ml细胞裂解缓冲液 ， 迅速吹散沉淀 。 加入20ul蛋白酶K（0.2mg/ml） ， 混匀 。 在65℃恒温水浴锅中水浴30min ， 或转入37℃水浴12～24h ， 间歇振荡离心管数次 。 于台式离心机以12000 rpm离心5min ， 取上清液入另一离心管中 。
3、加入等体积酚：氯仿：异戊醇抽提一次 ， 温柔混匀 。 4℃条件下 ， 10000rpm ， 离心10min 。
4、轻轻吸取上层液面 ， 注意不要吸到两层之间的白色沉淀 。 如上层液面中白色沉淀较多或浑浊可以再次加入等体积酚：氯仿：异戊醇抽提一次 。
5、向吸取的上清液中加入1/10体积的NaAc ， 轻柔混匀 ， 然后加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇 ， 轻柔混匀后 ， -20℃冰箱中沉淀过夜 。
6、12 000rpm 离心 20min ， 弃上清；加入-20℃预冷的75％乙醇 ， 12000rpm 离心 15min 室握温干燥 ， 加入适量无菌水溶解基因组DNA ， 存放于 4℃ ， 如溶解不充分可轻摇溶解过夜 。
注意事项
1、选取的组织须是新鲜材料 ， 且处理时间不宜过长 。
2、操作过程尽可能在低温条件进行 ， 避免基因组DNA降解或断裂 。
3、使用酚：氯仿：异戊醇 ， 乙醇抽提或沉淀DNA时须轻柔操作 ， 避免DNA降解或断裂 。
4、实验中会使用到有机试剂 ， 须注意防护 ， 并在通风条件下进行操作 。
常见问题及分析
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