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【维真生物 】提供现货产品、载体构建、病毒包装、细胞系建立等服务
一．Cre-loxP重组系统作用原理
1. Cre重组酶和loxP位点
Cre重组酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码 ， 是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质 。 它不仅具有催化活性 ， 而且与限制酶相似 ， 能够特异性识别loxP位点 。
LoxP（locus of X-overP1）位点长为34bp ， 包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域 。 其中 ， 反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点 ， 而间隔区域决定了loxP位点的方向 。
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图1. Cre重组酶和loxP位点
（http://2012.igem.org/Team:Tsinghua-A/Project/Design）
2. Cre-loxP重组系统诱导基因重组的方式
Cre-loxP系统存在几种诱导重组的方式 ， 这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的 。
当基因组内存在loxP位点时 ， 一旦有Cre重组酶 ， 便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体 。 此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合 ， 进而形成四聚体 。 随后 ， loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下 ， 切口在DNA连接酶的作用下重新连接 。 重组的结果取决于loxP位点的位置和方向 。 主要存在几下几种重组方式：
（1） 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同 ， Cre重组酶敲除loxP间的序列；
（2） 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反 ， Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转；
（3） 两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上 ， Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位；
（4） 四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上 ， Cre重组酶诱导loxP间的序列互换 。
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【Cre-loxp|知识分享：AAV Cre-loxp重组系统】图2. Cre-loxP诱导基因重组的方式
（https://www.tumblr.com/search/rolling%20circle%20replication）
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二．维真生物 Cre-loxP重组系统的AAV载体构建和病毒包装服务
维真生物 Cre-loxP重组系统AAV载体
维真生物 Cre-loxP重组系统 腺相关病毒
Cre重组酶诱导表达的FLEX-ON系统
Cre重组酶反式剪接系统
1. 依赖Cre重组酶诱导表达的FLEX-ON系统
结合组织特异性的启动子和不同的AAV血清型 ，FLEX-ON系统能完成更精准的组织特异性控制和时间控制 。
在FLEX-ON系统中 ， 目的基因反方向位于启动子下方 ， 两侧分别连接两个“头对头”的loxP 。 Cre重组酶不存在时 ， 目的基因不能表达；当Cre重组酶存在时 ， 可以诱导目的基因的“翻转” ， 从而表达 。
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图3. 维真生物提供依赖Cre的FLEX-ON系统示意图
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图4. 维真生物的FLEX-ON实验图
2. 依赖Cre重组酶反式剪接系统——轻松拥有“表达大基因的AAV”
较小的包装能力（小于5kb）使得AAV应用受到限制 。 维真生物为您提供依赖Cre的反式剪接系统 ， 让您轻松拥有“表达大基因的AAV” 。
多个重组AAV的共转染效率高达90% ， 维真生物将较大基因分为两部分构建于两个AAV载体上 。 通过ITR的重组、mRNA剪接和Cre-loxP消除ITR的对转录的抑制作用 ， 实现目的蛋白的表达 。 相比于单个载体维真生物提供的依赖Cre的反式剪接系统的表达效率约20% 。
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图5. 维真生物提供依赖Cre的反式剪接系统示意图
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图6. 维真生物的依赖Cre的反式剪接系统实验图
三．维真生物 Cre-loxP重组系统AAV操作方法
（一）体外实验
以2型AAV病毒为例 ， 维真生物为您推荐的MOI值104-105 ， 是根HEK293细胞得出的数据 ， 不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同 。 建议您感染目的细胞前 ， 进行预实验摸索最佳MOI值 ， 推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件 。
1. 为了节省病毒 ， 推荐使用96孔板进行预实验 。
2. 将目的细胞接种于96孔板中 ， 细胞融合率为50%为最佳 。 为保证细胞生长良好 ， 请保证细胞贴壁过夜 。
3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培养基中做1:10稀释（10-1） ， 以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7 。 可根据实际情况降低或提高稀释倍数 。
4. 取出提前准备好的96孔板 ， 先确定细胞生长状况是否良好 。 用准备好的病毒稀释液替代旧培养基 ， 注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组 。
5. 在加入病毒稀释液后 ， 请在12-24h后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适 ， 是否因为加入的病毒量影响细胞状态 。 如果细胞没有变化 ， 即所加病毒对细胞没有毒性 ， 可以继续培养 。
6. AAV病毒对细胞的感染较慢 ， 请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况 。
另：如果您选择的产品没有荧光标签请在96小时以后的不同时间段分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达 。
注：由于AAV组织特异性 ， 体外感染细胞的效率比较低 ， 所以我们强烈推荐您购买AAV用于动物实验 。
（二）体内实验
针对小鼠/大鼠来说 ， 研究不同的方向有不同的AAV注射方法 ， 详情可查阅维真生物官网 。
四．常见问题解答
1.重组AAV 安全吗?
迄今为止 ， 未发现野生型AAV有致病性 。 野生型AAV ， 在无需辅助病毒（如腺病毒）的存在下 ， 复制效率非常低 。 重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成 。 Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列 ， 因此重组AAV在理论上不具有复制的能力 。
2.哪些血清型的 AAV 可供选择？我该选用哪种AAV呢?
目前为您提供的AAV 血清型为AAV1 ， AAV2 ， AAV5 ， AAV7 ， AAV6 ， AAV8 & AAV9 。 请参阅下面指南中参考文献的建议 。
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请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表 ， 以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞 。
3.使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?
rAAV病毒滴度很高 ， 可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长 。
4.AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体?
纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定 。 建议您将AAV分装后 ， -80℃下长期保存 。
5.订制AAV服务 ， 客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?
您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选 ， 或者提供您的质粒DNA或DNA序列 ， 我们将基因克隆至AAV载体 。 您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型 。
基因沉默服务 ， 请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体 。 我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记 。
通常情况下 ， 可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL 。 也可根据客户的需要 ， 提供特定体积和滴度的产品 。
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