克里米亚-刚果出血热病毒幸存者体内分离出人源保护性中和抗体

撰文 | 望夜

责编 | 兮

2018年，世卫组织将包括埃博拉病毒、马尔堡病毒、MERS、SARS在内的10种病毒病列为优先考虑的传染性病原，其中也包括克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo haemorrhagic fever virus ， CCHFV）。

CCHFV是一类由蜱虫传播的可以引起严重出血热症状的烈性病毒，感染致死率通常在5%-30% ，但在某些暴发波次甚至高达80% ，需要在生物安全4级实验室中操作。 CCHFV隶属布尼亚病毒目（Bunyavirales）下的内罗病毒科（Nairoviridae），是一类分节段的负链RNA病毒。 CCHFV通常由携带病毒的璃眼蜱属（Hyalomma）叮咬传播或接触被病毒污染的家畜而感染，也曾有院内感染的报道。该病毒已经波及欧亚非多国并形成本地流行，成为传播范围最广的蜱传病毒。目前尚无特效治疗药物。

CCHFV的基因组分成三个节段（S、L、M），分别编码核蛋白、糖蛋白前体及RNA依赖的RNA聚合酶。依照M节段序列的系统发育关系， CCHFV分为七个分支（clade I-VII）。糖蛋白前体经转录翻译加工，生成病毒囊膜表面的两种结构蛋白Gn和Gc ，及三种分泌型蛋白（GP38、GP85、GP160），其中， Gn负责病毒颗粒对受体细胞的粘附， Gc介导膜融合。类似于其它布尼亚病毒，目前认为内罗病毒属的Gc也是II型病毒囊膜蛋白，即C端在膜内的单次跨膜蛋白。

研究发现， CCHFV感染者血清中抗体的缺失与病人的感染致死率密切相关，提示抗体在保护感染者免于死亡中发挥作用。但目前仅有鼠源抗体发表，分别靶向CCHFV的Gc、Gn和GP38 。而根据近期在其它烈性病毒，如埃博拉病毒中的研究，康复患者血中可以分离到具备治疗效果的中和抗体，甚至在感染后出现症状时再使用依然有效。

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延续这种策略， 2021年6月1日，美国爱因斯坦医学院的Kartik Chandran教授课题组联合Adimab、Mapp公司及美国陆军传染病研究所的合作者在Cell杂志发表了题为Protective neutralizing antibodies from human survivors of Crimean-Congo hemorrhagic fever的研究文章，首次报道在四名CCHFV感染幸存者体内发现361株靶向Gc和GP38的人源单克隆抗体。实验证实其中的高效中和抗体靶向Gc上的6个保守抗原表位，靶向表位不同的抗体可以通过协同作用发挥预防效果。进一步将其中的高效抗体改造为双特异性抗体，获得了一株可以有效保护小鼠免受致死剂量CCHFV攻毒的抗体。

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【克里米亚-刚果出血热病毒幸存者体内分离出人源保护性中和抗体】作者首先构建了重组蛋白rGn/Gc作为诱饵，在四位CCHFV康复患者的血样中进行单个记忆B细胞的流式分选，经过测序，在酵母工程菌株中进行单抗的异源表达，最终得到361株抗体。而后，研究者使用生物膜干涉检测了全部抗体对rGn/Gc和Gc的结合能力，发现超过80%的抗体均可结合两种抗原，另有部分抗体特异性结合GP38 ，但全部抗体均不结合Gn 。进一步地，检测这些抗体对三种分支（Clade III、I、V）来源的rGn/Gc的交叉结合能力，发现绝大部分的Gc特异性抗体均可同时结合三种分支来源的抗原，另有7株GP38特异性的单抗也存在交叉反应。

接下来，作者通过比较全部抗体与7个靶向Gc不同表位的Fab片段的竞争实验，确认大部分抗体均靶向六种表位中的一种。为确认抗体靶向的具体表位序列，作者对上述已进行表位分类的抗体进行表位定位实验：使用表面表达有Gc突变体的酵母文库，进行三轮荧光激活的流式分选，通过对Gc突变体的测序，最终确定了6组表位的具体序列信息，并将这些表位信息，在Gc结构模拟图上进行了定位（图1）。

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图1 抗体的六组表位序列及其在Gc结构模型上的定位

为确定筛选出的单抗的中和效果，作者构建了包含全部结构蛋白及Nano-Glo荧光素酶报告基因的病毒样颗粒tecVLP ，可以模拟真实病毒的入侵，用于对小分子和单抗的评估。以恒定的抗体浓度（35 nM），检测全部抗体对分支IV阿曼毒株tecVLP的中和效果，发现靶向Gc融合肽和结构域II的抗体显示最强的中和活性，而全部GP38特异性单抗均不具备中和活性。作者还进一步测试了活性较强抗体的广谱中和能力，确定三株抗体ADI-37801 （表位1 ，靶向融合肽）、ADI-36121 （表位3 ，靶向结构域 II）和ADI-36145 （表位6 ，靶向结构域III）用于后续实验（图2）。

克里米亚-刚果出血热病毒幸存者体内分离出人源保护性中和抗体

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