由单细胞层面探究鼻咽癌的肿瘤异质性和细胞间的互作网络( 二 )
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CD8+细胞的多样性与耗竭T细胞的分化产生
接下来 ， 作者主要关注了CD8+T 细胞亚群 ， 常规介绍了这些亚群的表达特征 ， 在不同组别中的分布特点 ， 然后与上文一样 ， 通过差异分析和富集分析开始说明具体的细胞亚群功能 ， 例如 ， 举例肿瘤细胞毒性CD8T细胞簇(CD8_C7_GZMK、CD8_C8_MHC和CD8_C9_XCL1)具有与细胞因子产生和淋巴细胞激活相关的途径富集；CD8_C5_CX3CR1富集在白细胞跨内皮迁移和白细胞迁移相关的途径中 。 接下来 ， 作者通过拟时序分析来说明CD8+T不同状态下的过度与表达情况 。 值得一提的是作者使用了TCR、基因表达对T细胞的扩增分布、迁移和转化能力等进行了量化 。 并且与拟时序分析进行了结合 ， 作者发现肿瘤内耗竭的CD8+T细胞和发挥免疫抑制的调节性T细胞可能分别来源于外周血中的CX3CR1+CD8+T细胞和幼稚的调节性T细胞 。 CX3CR1+CD8+T细胞不仅具有高细胞毒性和高迁移能力 ， 并且与肿瘤内浸润的CD8+T细胞共享大约10%的TCR克隆型 。 这些结果说明 ， CX3CR1+CD8+T细胞具有潜在渗透进入肿瘤组织的能力 ， 并且可以通过TCR识别杀伤肿瘤细胞 。 这些结果亦提示潜在的细胞治疗策略 ， 即可以通过在体外扩增鼻咽癌病人外周血中的CX3CR1+CD8+T细胞亚群 ， 再回输到病人体内进行细胞治疗；或者利用CX3CR1修饰T细胞来增强T细胞的迁移和进入肿瘤的能力 。
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NPC中Treg细胞的多样性和发展轨迹
接下来作者运用了与CD8+T 分析类似的方法 ， 首先将11,631个细胞分在了4个细胞簇中 ， 分别为Treg_C1_SELL、Treg_C2_HSPA1A、Treg_C3_MKI67和Treg_C4_TNFRSF4 ， 接下来依旧是比较这些细胞在组间的差异 。 接下来 ， 作者进一步提出了对每一个细胞计算IL2R scores， 即基于CD25 (IL2RA), CD122(IL2RB), and CD132 (IL2RG)等基因（这三个基因编码跨膜蛋白 ， 形成一个受体复合体 ， 竞争性结合TL2(T细胞生长因子) ， 以抑制效应T细胞）的表达水平来进行计算【派森诺新版高级分析也包括该项目】 。 然后基于这些细胞的评分比较不同Treg cluster间的差异 。
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接下来作者继续使用了Monocle2来推断肿瘤内Treg的起源 ， 分析发现 Treg_C4_TNFRSF4作为终末端来源于两种发育轨迹 ， 其一是来源于PBMC的Treg_C1_SELL ， 其二是来源于肿瘤的Treg_C3_MKI67 ， 同时根据假时间轨迹分析 ， 大多数Treg_C2_HSPA1A细胞都在肿瘤中 ， 起源于Treg_C1_SELL细胞(常驻标记物的缺失表达可能表明最近从PBMC中招募了Treg_C2_HSPA1A细胞 。
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Treg拟时序分析图
作者又结合了TCR对CD4+T 进行了进一步的讨论 ， 在47384个CD4+T细胞中 ， 共有17624检测到了明确的克隆型 。 其中Treg_C2_HSPA1A和Treg_C4_TNFRSF4克隆下数量中等 。 值得注意的是 ， 在所有的CD4+T细胞中 ， Treg_C4_TNFRSF4的克隆细胞比例最大 ， 这意味着克隆更为丰富 。 同时 ， Treg_C4_TNFRSF4也是在Treg细胞簇中克隆扩增最多的 。 同时通过差异基因表达分析可知 ， Treg_C1_SELL的趋化因子受体CCR4表达很高 ， 这与NPC中CCL5、CCLC17和CCL22所对应 。 这些观察结果表明 ， 与瘤内细胞的迁移能力和趋化相互作用使外周Treg_C1_SELL细胞有可能向肿瘤募集 。 接下来作者使用TCR补充了这个验证 ， 观察到来自肿瘤和外周血的Treg细胞之间有少量共享的TCR 。 总的来说 ， 作者使用了拟时序分析、差异分析、配受体关系与TCR等方法共同验证了这一结论 。
NPC中B细胞的多样性（B细胞亚群分析）
解析完T细胞 ， 作者接下来对B细胞进行了讨论 。 作者将22892个B细胞分成了9个亚群 ， 其中3个亚群来自PBMC ， 另外6个来自肿瘤组织 。
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通过差异分析可以发现肿瘤细胞特异表达的一些基因 ， 例如干扰素诱导基因、应激基因等 。 接下来 ， 作者发现B_C4_IFITM3、B_C5_ISG15和B_C6_HSPA1A等细胞亚群在“EBV感染”、“病毒的防御反应”、“病毒致癌”和“干扰素-伽马的响应” 等途径富集 ， 暗示这三个亚群可能参与EBV感染的免疫反应 。
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肿瘤相关的LAMP3+DCs在NPC中显示出耐受性表型（髓样细胞亚群分析）
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