科研 | mSphere：多菌种肠道微生物群落中病原菌与共生菌个体间相互作用的研究
导读 肠道微生物群内共生细菌的相互作用以及与入侵病原体的相互作用是决定感染结果的关键 。 虽然小鼠研究很有价值 ， 但缺乏体外模型来监测单一物种水平上的病原体对群落的反应 。 作者建立了一个由9个代表性肠道物种组成的多物种群落 ， 作为一个混合生物膜一起培养 ， 并使用基于定量PCR（qPCR）的方法跟踪单个物种的数量 。 将主要的医院内肠道病原菌艰难梭菌引入该群落 ， 可增加共生菌的粘附力 ， 抑制艰难梭菌的增殖 。 有趣的是 ， 作者观察到 ， 随着艰难梭菌的抑制 ， 个别类杆菌种类却逐渐增加 。 此外 ， 类杆菌减少了艰难梭菌在生物膜内的生长 ， 这表明类杆菌在预防艰难梭菌定植中的作用 。 本研究定义的体外群落可以根据不同物种进行不同定制 ， 非常适合功能基因组 ， 是理解细菌间相互作用的宝贵工具 。
论文ID
原名：Dissecting Individual Interactions between Pathogenic and Commensal Bacteria within a Multispecies Gut Microbial Community
译名：多菌种肠道微生物群落中病原菌与共生菌个体间相互作用的研究
期刊：mSphere
IF：4.282发表时间：2021.3.24
通讯作者：Meera Unnikrishnan
通讯作者单位：英国考文垂华威大学华威医学院
实验设计
所有菌株在37°C厌氧条件下培养 。 对于具有多种微生物的混合生物膜 ， 单独的细菌培养物在SAB1中培养16至18小时（在37°C的厌氧柜中过夜） 。 然后用新鲜的SAB1稀释这些培养物 ， 使混合培养物中每种物种在600 nm（OD600）处的最终浓度达到0.1光密度 ， 测定微生物的生物膜 。 在DNA提取之前 ， 将单氮化钠（PMA；生物氚）添加到40mM最终浓度的再悬浮样品中 ， 在黑暗中孵化10分钟（在厌氧柜中培养37°C） ， 随后基于苯酚氯仿的方法进行了DNA的萃取 ， 采用实时定量的PCR(qPCR)测定差异基因 ， 从而对艰难梭菌和多雷梭菌生物膜进行深入研究 。
结果
1 开发混合生物膜群落 ， 优化单氮化原(PMA)-QPCR跟踪方法为了开发一个由具有代表性的肠道物种组成的复杂的混合生物膜群落 ， 作者根据之前描述健康肠道微生物群物种的文献 ， 总共选择了9种肠共生物种（表1） 。 该物种的选择是基于高相对丰度、在多个地区（欧洲、美国和亚洲）存在 ， 以及序列基因组的可用性 。 细菌和细菌被过度代表 ， 这些属是肠道的优势门 。 如材料和方法所述 ， 这九种物种作为混合生物膜一起培养 。 为了追踪单个物种 ， 引物被设计为针对每个菌株的拓扑异构酶I(顶部I)或DNA环转酶亚基A(gyrA)区域 。 选择这些基因是与传统的16S基因不同 ， 它们基因组中只有一个拷贝数 ， 这提高了将DNA质量转化为细菌数的假设的准确性 。 为了准确地量化细菌 ， 必须只量化活性细胞/活细胞 。 标准的qPCR量化了所有的细胞 ， “死亡的”和“活跃的”一样 ， 这给出了一个种群中个体物种的不准确的丰富度 。 为了提高定量的准确性 ， 作者使用单氮化原钠(PMA)来防止“死亡”细菌的计数 ， 即那些细胞膜受损的细菌 。 PMA是一种光活化的DNA结合染料 ， 只能针对细胞膜破裂的细胞或“死亡”细胞 。 当PMA被光激活时 ， 它与双链DNA(dsDNA)共价结合 ， 交联两条链 ， 这种结合可以防止在PCR的过程中的DNA扩增 。 因此 ， 生物膜样本首先用优化浓度的PMA进行处理 ， 然后进行基因组DNA提取 ， 然后用QPCR进行分析（图1) 。表1 用于构建肠道微生物群落的有代表性的物种一览表
本文插图
本文插图
图1 用于量化混合生物膜中单个物种管道的示意图 。 样本为PMA（单氮原）处理 ， 以确保只有活细胞的基因组DNA定量 。 治疗后 ， 将细胞裂解 ， 提取DNA ， 然后对DNA进行QPCR定量 ， 随后转化为细菌数 。2 跟踪微生物群群落内的单个物种作者首先在一个包含9种生物的混合生物膜中跟踪单个物种的数量 。 在孵育至72小时的不同时间后检测到所有9个物种（图2） 。 青春期双歧杆菌和卵形双歧杆菌在早期（72小时前）均呈阳性趋势 ， 而热带双歧杆菌保持不变 ， 所有其他物种的数量均减少 。 72小时时 ， 所有物种的数量都出现了衰退 ， 这意味着培养基中有毒副产物的积累 ， 或营养耗尽 。 接种物中某些物种（类杆菌和类杆菌）的较低细菌数量（尽管通过光密度使数量正常化）似乎影响其在混合生物膜中的数量 。 结果表明 ， 生物膜内的物种 ， 甚至同一属内的物种 ， 表现出不同的行为 ， 类杆菌在最初的48小时内有阳性、中性和阴性趋势 。 值得注意的是 ， 当混合生物膜与单一细菌物种生物膜进行比较时 ， 某些群落成员的数量有显著变化 。 与单一生物膜培养物相比 ， 混合生物膜中的卵双歧杆菌和汉森布氏杆菌的数量在24小时时有所增加 ， 而其他成员 ， 如海洋双歧杆菌、真杆菌和大肠杆菌的数量则分别减少了80倍、25倍和20倍 ， 这些差异进一步表明 ， 单个细菌的动态受细菌群落内相互作用的影响 。 此外 ， 作者还测试了选定的成对细菌物种 ， 以比较它们在双物种生物膜和微生物群生物膜中的行为 。 作者研究了大肠杆菌培养与选定的物种是代表不同的门包括在群落 。 对于大肠杆菌而言 ， 当与任何一种除颚形瘤胃球菌外的细菌一起孵育时 ， 细菌数量没有变化 ， 这与混合群落中24小时内未变化的大肠杆菌数量相比（图2） 。 然而 ， 在与大肠杆菌共培养的生物膜中 ， 多雷双歧杆菌和汉森双歧杆菌生长得更好 ， 而青春期双歧杆菌和颚形瘤胃球菌生长得不太好 ， 与各自的生物膜单一培养物相比 ， 早熟粪杆菌保持不变 。 这些生长行为不同于微生物群落中观察到的（图2） 。 因此 ， 双物种生物膜相互作用与微生物群落中观察到的相互作用有很大的不同 。
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